K.L. Střešní, kandidát biologických věd, vedoucí katedry toxikologie a mikrobiologie,
A.E. Katelniková, kandidát lékařských věd, vedoucí skupiny specifické toxikologie,
M.N. Makarova, doktor lékařských věd, ředitel,
V.G. Makarov, doktor lékařských věd, profesor, zástupce ředitele pro vědu
Ústav pro preklinický výzkum
188663, Rusko, Leningradská oblast, Vsevoložský okres, osada Kuzmolovský, sv. Závodskaja, d. 3, bldg. 245
E-mail: [email protected]
Klíčová slova: preklinické studie viru chřipky u fretek základní manipulace měření tělesné teploty
Kryshen K.L., Katelnikova A.E., Makarova M.N., Makarov V.G. Vlastnosti experimentální práce s fretkami. Laboratorní zvířata pro vědecký výzkum. 2019; 2. https://doi.org/10.29296/2618723X-2019-02-10
Shrnutí
Dnes jsou fretky stále populárnější pro použití v biomedicínském výzkumu. Fretky mají jedinečné zootechnické vlastnosti, vysokou vnímavost k virulentním kmenům viru chřipky. Jsou široce používány v experimentálních studiích k posouzení imunogenních a ochranných vlastností vakcín proti chřipce, účinnosti antivirových léků. Virus chřipky způsobuje infekci u fretek, která se vyskytuje s klinickými příznaky podobnými chřipkové infekci u lidí (horečka, rýma, letargie, hubnutí atd.). Fretky navíc patří do řádu predátorů, což zvyšuje jejich hodnotu pro preklinické studie jako alternativního živočišného druhu k hlodavcům. Fretky však vyžadují speciální podmínky a veterinární péči.
Účelem tohoto článku je systematizovat literární údaje a naše vlastní zkušenosti s prací s fretkami v laboratoři. V pokusném teráriu jsou fretky obvykle chovány v klecích o výšce alespoň 50 cm a podlahové ploše v závislosti na tělesné hmotnosti od 1500 do 6000 cm 2 na 1 zvíře. V kleci musí být přítomny prvky obohacení prostředí ve formě houpacích sítí, schodů, tunelů, míčů. Parametry teploty a vlhkosti prostředí pro fretky se výrazně neliší od obsahu hlodavců. V experimentu s fretkou stačí běžný světelný cyklus 12 h den/12 h noc. Protože jsou fretky striktní masožravci, potřebují stravu bohatou na bílkoviny a tuky s nízkým obsahem vlákniny. V pokusu se nejčastěji používají mladí dospělí freťáci ve věku 5 až 12 měsíců, od 3 do 5 zvířat na skupinu. Zvláštní pozornost při experimentální práci s fretkami by měla být věnována anestezii. Plynová anestezie je tedy zpravidla nepřijatelná, protože opakovaná anestezie během experimentu vede k výrazným změnám v plicích. Jedním z hlavních parametrů pro hodnocení rozvoje chřipkové infekce u fretek je tělesná teplota. Článek navrhuje metodu měření teploty pomocí speciálních implantovatelných senzorů, která umožňuje přesně a správně sledovat dynamiku tohoto parametru v průběhu celého experimentu.
úvod
V experimentální práci fretky (Mustella putorius furo) se používají od 30. let 1. století; dnes je nejoblíbenějším modelovým objektem pro studium virových infekcí dýchacích cest, různých bakteriálních infekcí, patologií kardiovaskulárního systému, sluchu, zraku, dávivého reflexu atd. [2, 3]. Fretky jsou stále častěji zvažovány jako alternativa v toxikologických experimentech k větším zvířatům, jako jsou psi a primáti [XNUMX].
Fretky se nejvíce používají ve studiích účinnosti vakcín proti chřipce a antivirotik, protože tato zvířata jsou vysoce citlivá na virulentní kmeny viru chřipky. Viry chřipky B způsobují u fretek infekci, která probíhá s klinickými příznaky podobnými chřipkové infekci u lidí (horečka, rýma, letargie, hubnutí atd.) [4–7]. Vnímavost fretek k virům chřipky je dána přítomností v jejich dýchacím traktu α-2,6-vázané N-acetylneuraminové kyseliny (Neu5AC), která usnadňuje vazbu a zahájení replikace viru [8]. Po náhodném zjištění přirozené vnímavosti fretek k viru chřipky ve 1930. letech [9] bylo také zjištěno, že jsou vnímavé k dalším respiračním virům, včetně syncyciálního viru, parainfluenza virům a dalším [10].
Fretky patří do řádu predátorů, což zvyšuje jejich hodnotu pro preklinické studie. To je způsobeno skutečností, že většina dosavadních preklinických studií se provádí na hlodavcích, a pokud se ukáže, že studované léčivo je druhově specifické, bude existovat riziko nedostatečných informací získaných v preklinické fázi, což může vést k fatálním výsledkům při přechodu do fáze I. klinického výzkumu.
V literatuře přitom není dostatek praktických doporučení pro práci s dravými zvířaty. Účelem tohoto článku je systematizovat literární údaje a naše vlastní zkušenosti s prací s fretkami v laboratoři.
Základní fyziologické parametry fretek
Fretky se dožívají v průměru 6–8 let [2]. Samci mohou být dvakrát větší než samice. U obou pohlaví jsou pozorovány sezónní výkyvy tělesné hmotnosti v rozmezí 30–40 %, protože množství podkožního tuku se na podzim zvyšuje a na jaře klesá [11].
Srdeční frekvence a krevní tlak u fretek se liší v závislosti na stavu zvířete v době studie. U zvířat v narkóze se tepová frekvence pohybuje v rozmezí 200 až 400 za minutu v závislosti na použitém anestetiku. Frekvence dýchacích pohybů u fretky v klidu je přibližně 33–36 za minutu (tab. 1).
Hlavní biologické parametry fretek [2; 12]
Parametr
Rozsah hodnot
Od 5-11 let. Průměrně 6-8 let
Tělesná hmotnost dospělého
♀ (1000–2000 g), ♂ (500–1000 g)
Průměr 8 (od 1 do 18 v rozsahu)
200-400 za minutu
systolický krevní tlak
diastolický krevní tlak
110-125 mmHg Umění.
normální tělesná teplota
Denní objem moči
Fretky pohlavně dospívají na prvním jaře po narození, kdy jsou přibližně 6–12 měsíců staré. Jsou to sezónní zvířata, samice jsou aktivní od března do září a samci od prosince do července. Období rozmnožování je určeno délkou denního světla, které je vnímáno epifýzou, takže toto období lze ovlivnit změnou světelných cyklů. U mužů je vývoj varlat stimulován krátkým denním světlem. Začíná v prosinci a končí v únoru až březnu.
Literatura o těchto zvířatech popisuje hematologické, biochemické parametry a hladiny hormonů zdravých fretek [1, 2, 11, 12], což může být užitečné při interpretaci výsledků jednotlivých studií.
Vlastnosti chovu fretek
Fretky se cítí dobře v teplotním rozmezí od 15 do 24ºС, relativně dobře se však adaptují na chladnější teploty [2, 11, 13]. Fretky nesnášejí teploty nad 30ºC, zvláště v kombinaci s vysokou vlhkostí. Dospělá zvířata jsou náchylnější ke zvýšeným teplotám než mláďata kvůli špatně vyvinutým potním žlázám a tenké vrstvě podkožního tuku. Optimální vlhkost se pohybuje v rozmezí 40–65 % [2, 11]. Pro fretky použité pouze v experimentu stačí běžný světelný cyklus 12 h den/12 h noc. Cykly osvětlení lze změnit pro ovládání reprodukce (tabulka 2).
Hlavní parametry obsahu fretek
Parametr
Komentář
Minimální podlahová plocha na zvíře [1]
Až 600 g – 1500 cm 2
Více než 600 g – 3000 cm2
Dospělí – 6000 cm 2
Minimální výška buňky [14]
4–18ºС [2]; 15–24ºС [11]
Směnný kurz vzduchu [2]
Fotoperioda (cyklus den:noc) [2]
Pro chov a laktaci – 16:8
V experimentu – 12:12
Stejně jako u jiných typů laboratorních zvířat by měla být rychlost výměny vzduchu 10–15 objemů za hodinu. Je důležité používat nerecirkulovaný vzduch kvůli silnému zápachu a náchylnosti fretek k lidským respiračním infekcím, jako je chřipka. Pach fretek by se neměl dostat do prostor, kde jsou chováni hlodavci, protože hlodavci mají z fretek instinktivní strach, což může ovlivnit jejich celkový stav [2].
Pro fretky je vhodné skupinové i individuální ustájení. Samce fretek po 12 týdnech se doporučuje chovat individuálně [2].
Podle směrnice Evropského parlamentu a Rady Evropské unie 2010/63/EU ze dne 22. září 2010 o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely by podlahová plocha na 1 zvíře měla být od 1500 do 6000 cm2 v závislosti na těle hmotnost [14]. Pro chov fretek v experimentálním teráriu jsou vhodné velké klece s prvky pro obohacení prostředí, které fretce umožňují uvědomit si potřebu pohybu.
Fretky dávají přednost spánku v měkkém, izolovaném prostoru a ve viváriu výzkumného zařízení lze pro tento účel použít houpací síť na spaní (obrázek 1).
Pro obohacení biotopu lze do klece umístit různé hračky, tunely, míče, schody.
Materiál podestýlky je nezbytný pro všechny fretky. Kromě toho by měl být poskytnut materiál na stavbu hnízda, jako je seno, sláma nebo papír. Hluboká vrstva plniva může sloužit jako další prostředek k obohacení prostředí. Použití výplňového nebo savého materiálu zjednodušuje čištění a minimalizuje četnost mokrého čištění [13].
V přírodě fretky zabírají spíše úzký potravní výklenek a jsou přísnými predátory; jíst výhradně živočišnou stravu. Hlavní kořistí fretek jsou drobní myší hlodavci (hraboši a myši), někdy ptačí vejce, kuřata, mnohem méně často obojživelníci, ryby, velký hmyz. Fretky vůbec nejedí rostlinnou potravu, kromě malého množství, které se do jejich těla dostává ze žaludku obětí. V procesu evoluce se fretky na takovou výživu anatomicky a fyziologicky adaptovaly. Jejich gastrointestinální trakt je poměrně krátký, trávení potravy probíhá rychle (k úplnému strávení jsou zapotřebí pouze 2–4 hodiny), takže vyžadují specifickou, lehce stravitelnou potravu. Fretky nemají slepé střevo a mikroflóra v tlustém střevě je velmi špatná, takže jsou schopny strávit velké množství rostlinné potravy [1].
Při sestavování jídelníčku pro fretky je třeba věnovat zvláštní pozornost parametrům, jako je energie, aminokyselinové složení bílkovin a stravitelnost bílkovin. Protože jsou fretky striktní masožravci, potřebují stravu bohatou na bílkoviny a tuky s nízkým obsahem vlákniny. Dospělá zvířata vyžadují přibližně 200–300 kcal/kg. Krmivo pro dospělé fretky by mělo obsahovat 30–40 % bílkovin. Obsah tuku musí být omezen, jinak bude vstřebávání bílkovin a minerálů neúplné. Dostatečná hladina tuku je 18–20 % [2, 11]. Při chovu fretek v experimentálním teráriu je vhodné používat komerčně dostupná kompletní krmiva.
Požadavky na zdraví zvířat
V Rusku zatím nejsou žádné specializované školky pro chov fretek pro laboratorní výzkum. Existují však různé zvířecí farmy, kde se fretky pěstují pro kožešinové suroviny. Velké chovy zvířat mohou poskytnout dostatečný počet fretek určitého věku. V závislosti na provedení se tedy experimentu účastní 15 až 40 fretek stejného pohlaví. Ke zdravotnímu stavu fretek, jejich stravě v takových chovech se pečlivě přistupuje, aby byla zajištěna vysoká kvalita kožešinových výrobků.
Hlavním kritériem pro zařazení fretky do experimentu za účelem studia vakcín proti chřipce s následnou infekcí zvířat je nepřítomnost protilátek proti viru chřipky. Po převozu a karanténě by měly být fretky vyšetřeny na hladiny protilátek proti každému cílovému antigenu. Séropozitivní fretky by se neměly účastnit dalších studií. Fretky jsou extrémně náchylné k chřipkové infekci a sezónním virem se mohou nakazit od personálu, ve školce nebo v experimentálním teráriu. Podobně při práci s živým kmenem viru se může nakazit personál. To vede ke zvláštnímu požadavku na personál účastnící se a obsluhující zvířata v experimentu – zaměstnanci, kteří prošli sezónním očkováním proti virům chřipky, musí mít povoleno pracovat s fretkami. Během epidemie chřipky by zvířata měla mít možnost vidět pouze zdravý personál.
Přijetí zvířat z kožešinové farmy musí být doprovázeno jejich vyšetřením veterinárním lékařem. Fretky musí podstoupit karanténní období 20–30 dní před zahájením jakýchkoli postupů. V případě potřeby mohou být vyžadovány laboratorní a instrumentální studie k posouzení zdravotního stavu a další terapie.
Pohlaví, věk, počet zvířat v pokusu
Experimentální práce s fretkami se provádí na zvířatech obou pohlaví. Podle literatury se však pokusy provádějí častěji na samcích fretek než na fretkách (tabulka 3), což zřejmě souvisí s fyziologickými vlastnostmi samic během říje.
Pohlaví, věk a počet zvířat ve skupině
Pohlaví zvířat
Věk, měsíce
Počet zvířat ve skupině
