Zvednete-li za temné noci na palubu lodi planktonovou síť, speciální zařízení na chytání planktonních organismů, začne zářit fosforeskujícím zelenobílým světlem.
Za lodí pohybující se v oceánu často zůstává světelná stopa. Dokonce i ruka člověka spuštěná do moře začíná zářit.
Stačí se podívat lupou nebo mikroskopem na vzorek odebraný z planktonové sítě, aby bylo jasné, že příčinou fosforeskující záře jsou planktonní organismy, především medúzy. Jejich tvar je poměrně rozmanitý: existují medúzy ve tvaru talíře, kuželovité, polokulovité; Některé medúzy mají četná chapadla, zatímco jiné mají chapadla viditelná jen málo nebo žádná. Vyskytují se zde zástupci jak hydroidů (především z řádu trachylidů), tak scyfoidů, patřících do řádu korunkovitých medúz.
Trachylidní medúzy mají crossota (Crossota) a pantahogon (Pantachogon) na okraji deštníku je mnoho tenkých dlouhých chapadel. Deštník těchto medúz je tenkostěnný, ale svalnatý. plavou v krátkých, rychlých dávkách. Všechny ostatní hlubokomořské medúzy plavou velmi pomalu. Jejich deštník má tlustou, chrupavčitou mezogleu, která brání pulzujícím pohybům charakteristickým pro jiné medúzy.
Malé hlubokomořské medúzy Meator (Meator) zcela ztratil svůj typický medusoidní tvar. Vypadá jako průhledná koule s tmavým jádrem. Tyto medúzy žijí v hloubce 1 až 6 km ve tmě a chladu. Nejsou zde absolutně žádné rostliny, takže všichni obyvatelé hlubin moře buď vedou dravý způsob života, nebo se spokojí s mrtvými organismy, které klesají ke dnu z horních vrstev vody, bohaté na život.
Fosforická olindias je považována za jednu z nejkrásnějších medúz (Olindias phosphorica), nebo jinými slovy – fosforová nebo svítící medúza. Patří do třídy Hydroid (hydrozoa), podtřída Limnomedusa (Limnomedusae).
Jedná se o mimořádně krásného mořského živočicha, který vydává atraktivní záři. Medúza phosphorus olindias je extrémně vzácné zvíře a mnoho podvodních fotografů tráví měsíce a roky zachycením tohoto přírodního zázraku. Skutečně, způsob, jakým Phosphorus Olindias nese svůj zářící deštník, je nezapomenutelný pohled.
Olindias fosforečná žije u pobřeží Japonska, Argentiny a Brazílie a zpravidla se zdržuje v pobřežních vodách blízko samého dna. Průměr deštníku tohoto druhu medúzy dosahuje 15 centimetrů. Svítící medúza se živí malými rybami a planktonem. Fosforické olindie se mohou stočit a rozvinout svá chapadla, aby zachytily kořist. Oběť je zasažena jedem z chapadel, načež je poslán do úst a dále do žaludeční dutiny.
Pro lidi tato svítící medúza představuje určité nebezpečí se svými bodci, ale její kousnutí není smrtelné a obvykle způsobuje mírné podráždění, jako je kornout z Černého moře.
V hlubinách oceánu je vždy akutní nedostatek potravy, a proto jsou všichni obyvatelé hlubin neustále zaneprázdněni jejich hledáním. Je zřejmé, že obyvatelé hlubin, kteří mají speciální úpravy, které jim pomáhají získat potravu, mají výhodu nad ostatními obyvateli hlubin.
Hlubinné medúzy jsou přítomny téměř v každém vzorku vody získané z hlubin oceánu. Co jim umožnilo se tak rozmnožit a zaujmout jedno z prvních míst v počtu mezi obyvateli hlubin moře? Na první pohled je to těžké vysvětlit, zvláště s ohledem na jejich pomalost a primitivní organizaci. Hlubinné medúzy kořist nepronásledují, ale lákají.
Živí se převážně korýši, ale příležitostně jedí i jiné hlubokomořské živočichy a přitahují je jasným světlem.
Světlo ve tmě je jednou z nejúčinnějších návnad pro každého živého tvora, takže si ho medúzy lucernové osvojily, aby přilákaly potenciální kořist. Koneckonců, medúzy nejsou schopny pronásledovat kořist při hledání potravy, protože nejsou přizpůsobeny k rychlému plavání.
Všechny hlubokomořské medúzy mají načervenalou nebo nahnědlou barvu. Přítomnost červenohnědého pigmentu je spojena se schopností vyzařovat světlo. Stejnou barvou je natřeno i mnoho dalších hlubinných organismů nebo částí jejich těl, které jsou schopny vyzařovat světlo.
Látka podobná tuku luciferin je pomalu oxidována enzymem luciferázou, přičemž vyzařuje jasné světlo. Stejně jako se noční můry slétají za světlem lucerny, korýši se slétají za světlem medúz a za nimi další hlubokomořští živočichové, kteří se korýši živí. Stanou se kořistí medúzy, když se ocitnou v těsné blízkosti jejích chapadel.
Je třeba poznamenat, že účinnost je velmi vysoká, dosažená jako výsledek oxidační reakce luciferinu – je přibližně 50%. To je hodně, vezmeme-li v úvahu, že v jakýchkoli jiných reakcích, které produkují světlo, představuje pouze zlomek procenta, zbytek energie se spotřebuje na výrobu tepla.
Některé medúzy, které žijí blízko hladiny moře, mají také schopnost zářit. Mezi nimi je malá hydromedusa ratkea (Rathkea), medúza aequorea (Aequorea) a scyfoidní medúza Pelagia noční (Pelagia nochiluca). Často se tyto medúzy objevují ve velmi velkém množství a pak se zdá, že vlny hoří a na čepelích vesel se objevují ohnivé koule – medúzy na nich přilepené tak jasně září.
Nedávno byla objevena schopnost některých korálů zářit při vystavení ultrafialovým paprskům. Důvod tohoto jevu nebyl dosud stanoven, existují domněnky, že taková záře (fluorescence) usnadňuje procesy fotosyntézy řas symbiontů nebo chrání korály před nadměrným tvrdým ultrafialovým zářením. Některé druhy madrepore a jiných korálů mají schopnost zářit tímto způsobem.
Z bentických koelenterátů září někteří hydroidi a mnoho mořských peří. Schopnost zářit u těchto organismů však zjevně nesouvisí s výživou, protože září jasným světlem pouze při mechanické stimulaci. Schopnost těchto organismů náhle vydávat jasné světlo ve formě záblesku je zřejmě obranná reakce a slouží k odplašení zvířat, která na ně ve tmě náhodou narazí.
Genetické inženýrství umožňuje „naučit“ živé organismy a jejich jednotlivé buňky zářit tak, jak září mořské medúzy. O možnostech a perspektivách bioluminiscence, za kterou byla v roce 2008 udělena Nobelova cena, hovoří Ph.D. n., str. n. S. IBCh RAS Ilya Yampolsky.
“Nobel” za živé světlo
Bioluminiscence je fenomén světla vyzařovaného živým organismem. Září korály, světlušky, medúzy, červi a houby. Jedná se o velmi odlišné organismy představující různá království přírody. Taxonomická (klasifikační) diverzita organismů, které jsou schopné zářit, je velmi vysoká. Dobrý příklad pro její charakteristiku uvádí jeden z hlavních odborníků v oblasti bioluminiscence, nositel Nobelovy ceny za chemii za rok 2008, Osamu Shimomura.
Pokud vezmete plakát s vytištěným evolučním stromem všech živých organismů – zvířat, rostlin, hub a bakterií – a nastříkáte na něj barvu, bude to přibližně zobrazovat rozložení svítících tvorů podél stromu.
V souladu s tím jsou mechanismy luminiscence také odlišné. Podle moderních odhadů má fenomén bioluminiscence až 30 různých biochemických mechanismů. Z těchto 30 mechanismů dokázal Shimomura rozluštit čtyři a rozluštěno bylo celkem šest. Mezi svítícími organismy tedy neexistuje systematické ani biochemické spojení a biologický mechanismus tohoto jevu je znám pouze z 15–20 %.
Samotná luminiscence – záře – je formou uvolňování energie při chemické reakci – oxidaci. Jelikož je ale tato reakce biochemická, kromě oxidačního činidla (kyslíku) a redukčního činidla (substrát) se na něm podílí také enzym, s jehož pomocí může tělo ovládat záři.
Nejznámějším a nejpodrobnějším případem bioluminiscence je zelená záře medúzy. Aequorea victoria, jehož studium přineslo Shimomurovi Nobelovu cenu.
Zde je záře ještě komplexnější: na jejím vzniku se kromě enzymu ekvorinu podílí další protein – GFP (green fluorescent protein), který je zodpovědný za samotnou zelenou záři tvořící komplex s ekvorinem. Pokud vezmete ekvorin a kyslík odděleně, objeví se pouze záblesk modré barvy. V těle medúzy však ekvorin tvoří komplex s GFP a dochází mezi nimi k neradiačnímu přenosu energie. Kvantum modrého světla se přenese do GFP, který ho pohltí a vyzařuje zelené světlo. Tento mechanismus byl podrobně studován, nicméně jakou roli hraje v povaze tohoto jevu je stále zcela nejasné. Není jasné, proč medúza vůbec potřebuje vyzařovat světlo, ani proč je světlo zelené a ne modré. Mezitím je těžké to připsat nehodě: samotnou medúzu to stojí poměrně hodně, protože výroba dalších bílkovin ve velkém množství je velmi energeticky náročná.
Je třeba poznamenat, že Shimomura pracoval na GFP již v 60. letech. Izoloval GFP a charakterizoval jej, přičemž se také pokusil pomocí tehdy dostupných metod určit strukturu speciální skupiny atomů, která určuje barvu tohoto proteinu – chromoforu (řecky: „barvonosný“). Jak je zřejmé ze slova „bílkoviny“, tyto látky jsou obvykle bílé a bezbarvé. Malá část z nich – GFP a příbuzné – jsou barevné. Nyní je známo, že barva vzniká díky skutečnosti, že uvnitř molekuly proteinu dochází k chemické reakci, která je katalyzována samotným proteinem. To znamená, že protein obvykle katalyzuje interakci jiných látek a v tomto případě reakci uvnitř sebe sama. Protein má tvar soudku, v jehož samém středu jsou tři aminokyseliny, které spolu reagují za vzniku chromoforu. Navíc je v tomto případě chromofor schopen světlo určité vlnové délky nejen absorbovat (tedy získávat barvu), ale také jej vyzařovat (tj. zářit).
Zpočátku se Shimomurova práce nestala senzací a GFP byl na čas jen zajímavou příhodou. Poté však došlo k velkému rozvoji metod genetického inženýrství a molekulární biologie. Pomocí těchto metod bylo možné sekvenovat GFP, to znamená získat jeho aminokyselinovou sekvenci, poté ji přeložit do sekvence DNA, která ji kóduje, a poté tuto sekvenci najít pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce) v medúzách. Ukázalo se, že fluorescenční záře medúzy je zcela unikátní: je kódována pouze jedním genem. Tato jednoduchost umožnila klonovat tento gen a uměle vybavit buňky a živé organismy touto vlastností vložením genu do jejich DNA. To znamená
gen medúzy lze vložit do bakterie, která tento gen přečte, vytvoří potřebné proteiny včetně GFP a začne fluoreskovat.
Totéž udělali s hlístovými červy, čímž jasně potvrdili, že fenotypový, vnější znak fluorescence může být kódován pouze jedním genem. To již způsobilo skutečnou explozi zájmu o GFP jako slibnou biochemickou značku. Fluorescenci lze pozorovat buď pouhým okem, nebo fluorescenčními mikroskopy, a když je takto snadno pozorovatelná vlastnost zakódována pouze jedním genem, lze ji přenést téměř na jakýkoli organismus. Je snazší klonovat jeden gen než deset genů. Takže asi 25 let po objevení GFP se ukázalo, že jde o velmi užitečnou věc. Nyní existují stovky různých způsobů použití. Všechny se scvrkají na použití fluorescence k pozorování různých jevů, které se vyskytují v buňkách nebo celých organismech: genová exprese, vývoj tkání, kmenové buňky, chování rakovinných nádorů, vzájemné interakce proteinů, osud buněčných organel. Například,
rakovina nebo kmenová buňka umístěná v testovacím organismu se již nebude moci „zamíchat v davu“ – bude viditelná, ať už se nachází kdekoli.
Navíc její „potomci“, když se začne rozmnožovat, budou také nositeli „genu svítivosti“ a lékaři mohou vysledovat celou vznikající „populaci“. Mimochodem,
fluorescenční akvarijní ryby jsou také výsledkem klonování GFP, v přírodě neexistují.
Fluorescenční štítek je jako štítek, který lze „připevnit“ k čemukoli v buňce nebo organismu. Poté je vhodné sledovat, co se děje s označeným objektem. Zvláště žádané jsou proteiny s daleko červeným spektrem, protože v této oblasti jsou živé tkáně průhledné, dokonce i u savců. Tímto způsobem můžete prosvítit živým organismem a vidět nádor uvnitř něj. To znamená, že nádor, jehož buňky jsou geneticky modifikovány tak, že fluoreskují v této oblasti spektra, se umístí do pokusného zvířete a poté se vizuálně sleduje vývoj nádoru a jeho reakce například na chemoterapii na živém organismus. Další možnost je v embryu ve fázi, kdy buňky ještě nejsou specializované, označí si určitou část a vidí, jaké buňky z nich vyšly, jaké tkáně se vyvinuly. Při použití konvenčních metod to není tak snadné: standardní metody biochemického barvení vyžadují opakované manipulace, v důsledku čehož výsledek často není jasně pozorován.
Zdůrazněme ještě jednou, že zvláštností GFP je, že není zaveden zvenčí, injekcí, jako některé jiné fluorescenční značky, ale je zpočátku zakódován v genomu buňky nebo organismu. To nám také umožňuje studovat fungování samotného genomu, a to je i nyní velmi obtížný úkol. Přestože je již poměrně snadné „číst“ genom, stále není tak snadné pochopit „význam přečteného“: jak genom funguje, jaký je mechanismus pro realizaci genetické informace ve formě znaků v samotný organismus. Tomu se nyní věnuje nový obor, funkční genomika, která aktivně využívá výhod klonování GFP.
Žlutá, červená, modrá
V roce 1999 začal Sergej Lukyanov (nyní akademik Ruské akademie věd) v přírodě hledat proteiny podobné GFP. Hledání bylo úspěšné: nejprve byly nalezeny proteiny podobné GFP v barevných korálech, které jsou dobře známé potápěčským nadšencům v Rudém moři. A teprve nedávno, asi před 10 lety, se ukázalo, že veškerá tato rozmanitá krása je způsobena právě přítomností podobných proteinů GFP. nicméně
pokud GFP vyzařuje pouze zelené světlo, pak se ukázalo, že proteiny nalezené v korálech mají širokou škálu barev.
Navíc jsou všechny, stejně jako GFP, kódovány pouze jedním genem. To přineslo další příležitosti pro použití fluorescenčních značek v genomu: protože se „značky“ staly vícebarevnými, jejich arzenál se rozšířil. To znamená, že dnes s jejich pomocí můžete pozorovat tři nebo čtyři objekty současně. Navíc můžete pozorovat vzájemné ovlivňování proteinů v prostoru kvůli přenosu energie, to znamená, že změnou barvy můžete vidět konvergenci proteinů. Naše laboratoř pokračuje v hledání nových fluorescenčních proteinů a metod jejich využití. Při tomto hledání byly nalezeny zejména proteiny, jejichž svítivost lze přepínat pomocí světla různých vlnových délek (tedy různých barev). Pod vlivem jednoho světla fluoreskují, ale při vystavení jinému přestávají fluoreskovat. Toto je nová funkce – zapínání a vypínání značky.
Fluorescenční značky – chemické a genetické – nahradily izotopové značky, které byly dříve populární v biochemii a molekulární biologii.
Fluorescenční barvy jsou bezpečnější, levnější a lépe se skladují. To už je obrovský trh a v molekulární biologii je stále poptávka po nových barvivech s novými vlastnostmi.
Místo srdce ohnivý chromofor
Dalším důležitým cílem bylo zjistit, proč proteiny podobné GFP září různými barvami. Ukázalo se, že mají různé chemické struktury chromoforů. Oblast chemie spojená se studiem chromoforů světélkujících proteinů spadá do dvou otázek – jaká je jejich struktura a jak se získávají v přírodě. Není vždy možné pochopit, který chromofor je v proteinu, a to ani pomocí rentgenových difrakčních studií:
Na pozadí obrovské molekuly s desítkami tisíc atomů není snadné přesně určit ani složení, nemluvě o prostorové struktuře malého substituentu.
A často jsou to právě takové jemné efekty, které určují celý fenomén fluorescence. K vyřešení tohoto problému mohou být chromofory uměle syntetizovány. Porovnáním dat z různých metod se zjistí, která konkrétní skupina atomů je zodpovědná za fluorescenci a barvu konkrétního proteinu. Syntéza chromoforů často poskytuje odpovědi na otázky o jejich funkci, které nelze získat studiem celého proteinu. Jeho malý kousek, modelová sloučenina, může říci hodně o procesu fluorescence.
Naše poslední prácespojené se syntézou chromoforů, umožnilo vyřešit záhadu samotného chromoforu GFP, předchůdce světelných proteinů. to je to,
když je tato malá „cihla“ součástí proteinu, je to velmi jasné fluorescenční barvivo, ale samotný syntetický analog, který zcela opakuje strukturu přirozeného chromoforu, v roztoku téměř nefluoreskuje.
Zjistili jsme, že zde jde právě o prostorovou strukturu – relativní uspořádání atomů. V proteinu je fixován, „obložen“ sousedními aminokyselinami, ale v roztoku je volný a ohýbá se tak, že ztrácí své fluorescenční vlastnosti. Pokud však zavedete další prvek rigidity, který omezuje rotaci molekuly, objeví se fluorescence na přibližně stejně vysoké úrovni, která je charakteristická pro protein. Na základě přirozené struktury tak máme k dispozici nové nadějné fluorescenční barvivo, které, jak doufáme, najde praktické uplatnění.
